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人类首次人工合成活新冠病毒瑞士团队利用已知基因序列构建

AG体育在线:医药人才网 时间:2020-02-25 浏览量:

近日,瑞士一个科研团队在已知新冠病毒基因序列的基础上,通过反向遗传学手段在酵母菌中快速构建出了活的新冠病毒。该技术能高效合成新冠病毒,尤其在新暴发病毒尚未被成功分离出之前,可以帮助科学家尽快向卫生部门和实验室提供传染性病毒毒株,且该替代方案更为高效、安全。

以上成果披露自预印本网站BioRxiv于当地时间2月21日AG体育在线了一篇名为“Rapid reconstruction of SARS-CoV-2 using a synthetic genomics platform”的论文。该论文尚未经同行审议。研究团队首次在试验中,利用合成基因组学平台快速重建了新冠病毒。

值得注意的是,这是一项根据已知病毒基因组进行病毒重建的基础研究工作,该成果与此前的谣言之一“新冠病毒是人工合成的” 无关,本研究中实验室中构建的新冠病毒是在疫情暴发后,根据已经公布的病毒基因组序列进行的病毒重建研究。

该项研究的AG体育在线大多来自瑞士伯尔尼大学的科学家,他们联合德国、俄罗斯多所科研院校与相关卫生机构共同完成了上述成果。

研究团队认为,利用已知的病毒基因组序列,通过反向遗传学手段快速构建出了新冠病毒,可以成为向卫生部门和实验室提供传染性病毒毒株的替代方法,还可以对单个基因进行遗传修饰和功能表征,从而争取时间对疫情暴发做出快速反应。

论文中提到,反向遗传学被认为是一种不可或缺的工具,它彻底改变了我们对病毒发病机制和疫苗开发的认识。大型的RNA病毒基因组,如冠状病毒基因组,由于基因组较大且不稳定,很难在大肠杆菌宿主中克隆和操作。研究团队此次报道了一个基于酵母的合成基因组学平台,用于多种RNA病毒的基因重建,包括冠状病毒科、黄病毒科和副粘病毒科的成员。

AG体育在线研究人员可利用病毒分离物、克隆病毒DNA、临床样本或合成DNA生成病毒亚基因组片段,然后使用转化偶联重组技术 (TAR)克隆技术将基因组维持为酵母人工染色体(YAC),从而在酿酒酵母中实现一步重组。T7-RNA聚合酶被用于产生病毒RNA,进而可以产生活病毒。

研究团队首先在其他RNA病毒(如鼠肝炎病毒MHV)中检验了这一平台的准确度,团队测试了鼠肝炎病毒A59株中含有绿色荧光蛋白(MHV GFP)的基因克隆能力,结果表明测试的克隆中正确组装了MHV基因组的YAC占90%,这表明病毒在酵母中的组装效率很高。

也正是利用该平台,研究人员在拿到合成DNA片段后一周内,对新冠病毒进行了工程改造和复活。

病毒cDNA克隆及重组SARS-CoV-2和SARS-CoV-2-gfp的重建

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AG体育在线具体来看,研究团队将病毒基因组分成12个片段,大小在0.5kbp-3.4kbp。同时,为了便于血清学诊断和在细胞培养时追踪,研究团队将合成新冠病毒设计成可以表达GFP(绿色荧光蛋白)。因此,研究团队又将片段11分成3个包含GFP序列的子片段,GFP序列被插入ORF7a(开放阅读框,ORF)中从而在总计有14个片段。

研究团队让试剂AG体育在线化学合成上述14个DNA片段,1月14日下订单,2月4日拿到其中的12个片段。片段5和7在大肠杆菌中的克隆出现一些问题未能完成。不过,研究团队恰好同时获得了慕尼黑一位患者的新冠病毒样本(SARS-CoV-2/M�nchen1.1/2020/929),他们决定利用RT-PCR扩增获得片段5和片段7。

利用TAR克隆,对于所有6种新冠病毒构建体,研究人员都获得了正确组装的分子克隆。随后,利用转化偶联重组技术 (TAR),用酵母菌的同源重组系统依据末端重复的序列,将这些DNA序列拼到一起。获得完整的病毒序列后,用T7 RNA聚合酶将这一DNA序列转录为病毒RNA,将该RNA用电穿孔技术导入到VeroE6(猴肾细胞)中,使得细胞被感染,培养这些细胞的上清液(含释放出的病毒颗粒)注入到别的培养基中,可以感染别的细胞。

研究团队进而表示,“我们能在获取病毒的合成DNA片段后仅一周的时间内,对最近流行的新冠病毒的化学合成克隆进行工程改造和复活。”病毒的重组有很高的效率和准确度,通常情况下,超过90%的克隆是正确的。

值得注意的是,AG体育在线们指出,尽管此前在酵母中进行同源重组已被用于很多分子病毒的克隆,但这一研究在对通过这种方法快速生成大型RNA病毒的全长cDNA的可行性进行了全面评估,尤其是这种大型RNA病毒在大肠杆菌中无法被稳定克隆。

利用合成基因组学平台克隆RNA病毒基因组

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值得注意的是,除新冠病毒外,研究团队还报道了利用该技术合成构建MHV(鼠肝炎病毒,一种冠状病毒)和MERS-Cov等,HCov-229E和Zika病毒的构建仍在实验进行中。


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